Im Rahmen unserer Forschungsarbeit setzen wir verschiedenste Modelle und Methoden ein, um den Fortschritt auf dem Gebiet der Veterinär-Physiologie voranzubringen.
Welche Methoden und Modelle setzen wir ein?
Stücke gastrointestinaler Epithelien werden von den darunter liegenden Muskel- und Bindegewebsschichten isoliert. Diese werden in Inkubationskammern (Ussing-Kammern) eingespannt und können dort mehrere Stunden lang unter definierten Bedingungen untersucht werden.
Diese Methode hat den Vorteil, dass Untersuchungen gezielt auf epitheliale Prozesse ausgerichtet werden können, aber dabei – im Gegensatz etwa zur Zellkultur - der natürliche Zellverband erhalten bleibt. An den Epithelpräparationen können einerseits die elektrophysiologischen Charakteristika (transepithelialer Strom, transepitheliale Leitfähigkeit) erfasst werden, andererseits kann unter Nutzung radioaktiver Markierungen der Transport verschiedener Substrate, z.B. Nährstoffe, über und in die Gewebe qualitativ und quantitativ erfasst werden.
Untersuchungen an kultivierten Epithelzellen haben den Vorteil, dass epitheliale Regulationsmechnismen frei von systemischen Einflüssen untersucht werden können, definierte Zellpopulationen für die Untersuchungen verwendet werden und auch längerfristige Manipulationen an den Zellen möglich sind. Im Institut stehen von uns etablierte Primärkulturen oviner Pansenepithelzellen, porciner Colonepithelzellen und equiner Jejunumepithelzellen zur Verfügung.
Durch Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands ist es möglich die Integrität des „Zellrasens“ sowie Veränderungen derselben durch körpereigene und körperfremde Stoffe zu dokumentieren.
Stärker noch als bei primärkultivierten Epithelzellen können in Zellinien Untersuchungsbedingungen für epitheliale Regulationsmechanismen auf zellulärer und molekularer Ebene standardisiert werden. Im Institut steht eine hier entwickelte und etablierte Zelllinie aus porcinen Colonepithelzellen zur Verfügung. Die Zellen stammen aus primären Colonepithelzellen vom Ferkel und wurden mit SV40 transduziert.
Ebenso wie Epithelpräparationen haben auch Präparate aus gastrointestinaler Muskulatur mit anhaftendem myenterischen Plexus den Vorteil, dass sie ex vivo untersucht werden können, die Integrität des ursprünglichen Gewebeverbands aber weitgehend erhalten bleibt. Wir benutzen solche Präparationen zum einen zur funktionellen Untersuchung nervaler Schaltkreise, die die Colonmuskulatur steuern. Weiterhin ist es möglich und im Institut etabliert, besagte Nerv-Muskel Präparationen für mehrere Tage zu kultivieren um beispielsweise mit Hilfe retrograder Farbstoffe, die Innervationsmuster der vorhandenen Nervenzellen direkt zu identifizieren.
Im Institut sind verschiedene molekular- und zellbiologische Techniken etabliert, die Proteinnachweise und Quantifizierungen erlauben. Dies erfolgt zum einen mittels Western Blot. Weiterhin werden verschiedene epitheliale Proteine (Transportproteine, Rezeptoren sowie Cytoskelett- und tight junction- Bestandteile) und Neurotransmitter des enterischen Nervensystems mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen. Neben dem reinen Nachweis und der Lokalisation der Proteinstrukturen kann Software-unterstützt auch eine Quantifizierung vorgenommen werden.
Veränderungen der Genexpression z.B. durch Regulationsmechanismen oder Noxen werden mittels RT-qPCR untersucht. Dafür steht im Institut das notwendige Equipment sowie die Expertise zu RNA-Extraktion, cDNA-Synthese, herkömmlicher Reverse Transkriptase PCR sowie real-time PCR zur Verfügung.
Mit Hilfe von Luciferase-gekoppelten Assays besteht die Möglichkeit, viele verschiedene Funktionen von Zellen zu überprüfen. Dabei erfolgt in der Regel eine Reaktion des zu untersuchenden Pathways mit einem Coenzym, das wiederum mit der Luciferase reagiert und diese anregt. Die so hervorgerufene Lumineszenz kann als Indikator für die Menge des reagierenden Substrats bzw. Aktivität des zugrunde liegenden Pathways gemessen werden.
Demnächst verfügbar
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