Forschung am Hund

Nichtkonventionelle T-Zellen des Hundes

Zu den Lymphozyten, den Zellen der adaptiven Immunität, gehören B- und T-Lymphozyten. Während die B-Lymphozyten zur humoralen (lat. humor = Flüssigkeit) Abwehr gezählt werden, da sie Antikörper produzieren und diese ins Blut abgeben, übernehmen die T-Zellen verschiedene Aufgaben innerhalb der zellvermittelten Immunität. Konventionelle T-Zellrezeptor (TCR)aβ T-Zellen können generell in zwei Subpopulationen aufgeteilt werden: CD4⁺ T-Zellen und CD8⁺ T-Zellen, also Zellen, die entweder den CD4- oder den CD8-Rezeptor (Cluster of Differentiation 4 bzw. 8) auf ihrer Oberfläche exprimieren. Der Korezeptor spielt eine entscheidende Rolle für die optimale Aktivierung der T-Zelle, indem er an konservierte Strukturen von antigenpräsentierenden Molekülen bindet: CD4 an MHC (Major Histocompatibility Complex)-II und CD8 an MHC-I. CD4⁺ T-Zellen werden auch T-Helferzellen genannt, da sie durch Interaktion mit antigenpräsentierenden Zellen und Ausschüttung diverser Zytokine/Botenstoffe zur Aktivierung von Makrophagen, zur Differenzierung von B- zu Plasmazellen, oder auch zur Neutrophilenrekrutierung beitragen . Eine Unterpopulation der CD4⁺ T-Helferzellen (sog. Regulatorische T-Zellen) wirkt regulatorisch einem Überschießen des Immunsystems entgegen. CD8⁺ T-Zellen sind bekannt als zytotoxische T-Zellen und ihre Aufgabe ist die Eliminierung von körpereigenen Zellen, wenn diese beispielsweise virusinfiziert oder zu Tumorzellen mutiert sind.

Lange ging man davon aus, dass T-Zellen, die sowohl den CD4- als auch den CD8-Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimieren, sogenannte CD4⁺CD8⁺ doppelt-positive (dp) T-Zellen, ausschließlich als unreifes Entwicklungsstadium im Thymus vorkommen. Mittlerweile konnten reife dp T-Zellen jedoch auch außerhalb des Thymus bei verschiedenen Spezies nachgewiesen werden: Beim Menschen erstmals durch Blue et al. 1986 (1), außerdem beim Schwein (2), bei Hühnern (3), Affen (4), Ratten (5), und bei Mäusen (6).  Der Nachweis im peripheren Blut von Hunden gelang im Rahmen einer Forschungsarbeit aus dem Institut für Immunologie der Veterinärmedizinischen Fakultät Leipzig (7).

TCRγδ T-Zellen stellen eine separate Linie nichtkonventioneller T-Zellen dar und sind häufig mit einem CD4^-CD8α^- doppelt-negativen (dn) Phänotyp assoziiert. Basierend auf frühen Untersuchungen der vergleichenden Immunologie, wurden “γδ T-Zell-reiche” (15-50%; z.B. Schwein, Schaf, Rind, Huhn) und “γδ T-Zell-arme” Arten (<10%; z.B. Mensch, Maus) identifiziert (Review: (8)) Der Hund wurde später in die zweite Kategorie eingeordnet, da nur 1-2% der zirkulierenden Lymphozyten den TCRγδ exprimieren (9). Kürzlich konnte durch unsere Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass ~40% der kaninen TCRγδ-Population weder CD4 noch CD8a exprimieren. Demzufolge stellen TCRγδ dn T-Zellen eine kleine Population von ~0.5% der peripheren Lymphozyten des Hundes dar (10).

Überraschenderweise identifizierten wir in derselben Studie jedoch eine hohe Frequenz nichtkonventioneller TCRαβ⁺ CD4^-CD8α^- doppelt-negativer (dn) T-Zellen in gesunden Hunden (10).

Referenzen:

(1) Blue ML, J Immunol. 1986 Aug 15;137(4):1202-7
(2) Saalmüller A, Eur J Immunol. 1987;17(9):1297-301
(3) Luhtala M, Eur J Immunol. 1997;27(1):189-93
(4) Akari H, Int Immunol. 1997;9(4):591-7
(5) Takimoto H, Eur J Immunol. 1992;22(1):159-64
(6) Mosley RL, Int Immunol. 1990;2(4):361-5
(7) Schütze N, Vet Microbiol. 2009;137(3-4):260-7
(8) Holderness J, Annu Rev Anim Biosci. 2013;1:99-124
(9) Faldyna M, Vet Immunol Immunopathol. 2004;104(3-4):239-47
(10) Rabiger FV, Front Immunol. 2019;10:2748

Beantragte und bewilligte Projekte:

DFG:

• "Phänotypische und funktionelle Analyse caniner peripherer CD4⁺CD8⁺ doppelt-positiver T-Zellen" (Projekt: 173176068 )

Weiterführende Studien

Durch Studien des Instituts für Immunologie konnte gezeigt werden, dass diese T-Zell-Subpopulation des peripheren Blutes sowohl aus CD4⁺ T-Helferzellen als auch aus CD8⁺ zytotoxischen T-Zellen entstehen kann (1-2). Zudem ist ein großer Anteil konstitutiv aktiviert (3) und produziert große Mengen des Zytokins Interferon-γ (IFN-γ) (4). IFN-γ ist besonders wichtig für die zelluläre Immunantwort, beispielsweise im Rahmen von Virusinfektionen oder Tumorerkrankungen. Diese Eigenschaften machen canine CD4⁺CD8⁺ dp T-Zellen besonders interessant, da sie perspektivisch therapeutisch genutzt werden könnten. Am Institut für Immunologie konnte weiterhin gezeigt werden, dass canine CD4⁺CD8⁺ dp T-Zellen des peripheren Blutes nicht nur Effektorfunktions-, sondern auch regulatorisches Potential besitzen (4). Dies verleiht dp T-Zellen einen heterogenen Charakter, der sowohl protektiv als auch schädlich für den Körper sein könnte. Dementsprechend ist noch nicht klar, welche Rolle dp T-Zellen bei Krankheitsgeschehen, beispielsweise Autoimmunerkrankungen oder Infektionen, spielen. Um dieser Frage auf den Grund zu gehen, wurde in einer darauffolgenden Studie die Verteilung von CD4⁺CD8⁺ dp T-Zellen in verschiedenen Organen gesunder Hunde untersucht. Hierbei fiel auf, dass besonders viele CD4⁺CD8⁺ dp T-Zellen in mukosalen Organen, wie z. B. Darm oder Lunge als typische Eintrittspforten für Infektionserreger, zu finden sind (5). Die Ergebnisse der vorausgegangenen Studien in gesunden Tieren bilden die Basis für aktuelle Untersuchungen, die zum Ziel haben, die physiologische Funktion von caninen CD4⁺CD8⁺ dp T-Zellen weiter zu verstehen und ihre Beteiligung an verschiedenen Krankheitsgeschehen (z. B. entzündlichen Darmerkrankung des Hundes) zu beleuchten, was zur Entwicklung alternativer Therapiestrategien beitragen könnte.
Eine Zusammenfassung über canine CD4⁺CD8⁺ dp T-Zellen des peripheren Blutes findet sich im Review von Buttlar et al. 2015 (6).

Beantragte und Bewilligte Projekte:

DFG:

• "Phänotypische und funktionelle Analyse caniner peripherer CD4⁺CD8⁺ doppelt-positiver T-Zellen " (Projekt: 173176068)

Publikationen:

(1) Schütze N, Vet Microbiol. 2009 Jun 12;137(3-4):260-7
(2) Bismarck D, Vet Immunol Immunopathol. 2014 Dec 15;162(3-4):72-82
(3) Bismarck D, Vet Immunol Immunopathol. 2012 Oct 15;149(3-4):157-66
(4) Rothe K, Vet Immunol Immunopathol. 2017 Mar;185:48-56
(5) Rabiger FV, PLoS One. 2019 Mar 13;14(3):e0213597
(6) von Buttlar H, Vet Immunol Immunopathol. 2015 Dec 15;168(3-4):169-75

Kooperationen:

• Prof. Dr. Romy Heilmann (KTK, Leipzig, Deutschland)
• Prof. Dr. Gabriele Köhler (Klinikum Fulda, Deutschland)
• Dr. Peter Moore DVM, PhD (UC Davis, Kalifornien, USA)
• Prof. Dr. Gerhard Oechtering (KTK Leipzig, Deutschland)

Beteiligte Personen:

Dr. Maria Eschke

Ehemalige:

Dr. Heiner von Buttlar
Dr. Doris Bismarck
Anett Grohs
Dr. Friederike Rabiger
Dr. Kathrin Rothe

 

Weiterführende Studien

Bemerkenswerterweise weisen bis zu 15% der TCRaβ T-Zellen des Hundes im peripheren Blut sowie in lymphatischen und nicht-lymphatischen Organen einen CD4^-CD8α^- doppelt-negativen (dn) Phänotyp auf. Neben der deutlich höheren Frequenz im Vergleich zu Mensch (1) und Maus (2), besitzen kanine TCRαβ⁺ CD4^-CD8α^- doppelt-negative (dn) T-Zellen einige einzigartige Merkmale. So konnten bei der phänotypischen Analyse Untergruppen mit einem FoxP3⁺ regulatorischen T-Zell (Treg)-ähnlichen, einem GATA-3⁺ T-Helfer 2-Zell (Th2)-ähnlichen und einem FoxP3⁺GATA-3⁺ Hybrid-Phänotyp identifiziert werden (3). Diese interessanten Untergruppen nichtkonventioneller TCRaβ dn T-Zellen wollen wir nun funktionell charakterisieren, da sie eine wichtige Rolle in der Immunhomöostase und bei Entzündung spielen könnten.

Dabei kommen modernste immunologische und molekularbiologische Methoden zum Einsatz: Ausgewählte Markermoleküle werden mittels Durchflusszytometrie und Prime-Flow^TM RNA Assay untersucht. Zusätzlich werden TCRaβ dn T-Zellen mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) isoliert. Kürzlich haben wir das Potenzial der scRNA-seq genutzt, um einen hochdetaillierten Atlas der konventionellen TCRαβ+ T-Zellen von gesunden Hunden zu erstellen (4). 
Als besonders nützlich erwies sich dabei die kombinierte Analyse von Genexpression und Immunrepertoire, die die Entdeckung von MAIT*-ähnlichen Zellen beim Hund ermöglichte. Die etablierte Methode wollen wir nun anwenden, um die Besonderheiten nicht-konventioneller T-Zellen hinsichtlich der Genexpression und des T-Zellrepertoires aufzuklären. Dadurch sollen weitere spezifische Moleküle der Treg-ähnlichen, Hybrid-Treg-ähnlichen und Th2-ähnlichen dn T-Zellen identifiziert werden. Außerdem wird diese Analyse darüber hinaus wichtige Einblicke in die Heterogenität der TCRaβ dn T-Zellen geben. Schließlich wird der Hypothese, dass Treg-like dn T-Zellen ein eingeschränktes TCR-Repertoire besitzen, mittels 5‘ Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) und Next Generation Sequencing (NGS) nachgegangen.

Während die kleine Population von TCRγδ dn T-Zellen des Hundes im Unterschied zu den TCRaβ dn T-Zellen FoxP3-negativ ist, exprimiert ein beträchtlicher Anteil ebenfalls GATA-3 (3). Eine mögliche Beteiligung von TCRγδ dn T-Zellen an Th2-assoziierten Immunreaktionen wird daher ebenfalls untersucht.

*MAIT: Mukosa-assoziierte invariante T-Zellen

Beantragte und Bewilligte Projekte:

DFG:

• "Funktionelle Analyse nichtkonventioneller TCRαβ⁺ CD4^-CD8α^- doppelt-negativer T-Zellen des Hundes" (Projekt: 469323442)

Publikationen:

(1) Fischer K, Blood. 2005;105(7):2828-35
(2) Zhang ZX, Nat Med. 2000;6(7):782-9
(3) Rabiger FV, Front Immunol. 2019;10:2748
(4) Eschke M, Front Immunol. 2023;14:1123366
 

Kooperationen:

• Dr. Peter Moore DVM, PhD (UC Davis, Kalifornien, USA)
• Dr. Stefan Keller, PhD (UC Davis, Kalifornien, USA)

Beteiligte Personen:

Dr. Maria Eschke
Martina Protschka
Laura Winkler

Ehemalige:

Anett Grohs
Dr. Friederike Rabiger